GFP 綠熒光蛋白(Green Fluorescent Portein，GFP)

綠色熒光蛋白是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白，當(dāng)受到紫外或藍(lán)光激發(fā)時，發(fā)射綠色熒光。其獨(dú)特之處在于：它產(chǎn)生熒光無需底物或輔因子，發(fā)色團(tuán)是其蛋白質(zhì)一級序列固有的來源于水母的氨基酸殘基組成。水母的綠色熒光蛋白很穩(wěn)定，無種屬限制，已在多種動植物細(xì)胞中表達(dá)成功并產(chǎn)生熒光。GFP 的熒光受外界的影響較小，另外GFP 的檢測十分方便，而對細(xì)胞的傷害極小。(LUYOR-3260RB便攜式GFP激發(fā)光源可輕松激發(fā)GFP熒光，迅速定位GFP表達(dá)位置），由于這些優(yōu)點(diǎn)，GFP 已經(jīng)成為檢測體內(nèi)基因表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)原位定位的極為重要的報(bào)告分子。

2. 綠色熒光蛋白的表 達(dá)和成熟

GFP 的表達(dá)水平受多種因素的影響。在植物細(xì)胞中表達(dá)GFP 時，改變一些原GFP 基因的密碼子為該植物使用的偏愛密碼子，并消除潛在的剪接位點(diǎn)。目前適用于哺乳動物的表達(dá)系統(tǒng)不受影響。GFP 還可以順利的在無細(xì)胞的體外翻譯系統(tǒng)中表達(dá)并自發(fā)折疊。用一些小體積的氨基酸殘基取代大體積殘基可以提高GFP 在高溫下正確折疊的速度。這些突變位點(diǎn)分布于成熟蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的各個部位，幾乎不能提供如何幫助GFP 折疊和成熟的線索。另外，分子伴侶的存在也有助于GFP 的折疊，反過來，這個發(fā)現(xiàn)也使GFP 成為檢測分子伴侶功能的一個好底物，因?yàn)镚FP 可以提供一個連續(xù)的、無破壞性的檢測蛋白折疊成功的分析方法。

3. 綠色熒光蛋白的應(yīng)用

3.1報(bào)告基因和細(xì)胞標(biāo)記

GFP 作為報(bào)告分子和細(xì)胞標(biāo)記***明顯的優(yōu)勢是無需底物或輔因子參與；無論在活細(xì)胞還是在完整的轉(zhuǎn)基因胚胎和動物中，都能有效地監(jiān)測基因轉(zhuǎn)移的效率。但在這方面的應(yīng)用中，更大的缺點(diǎn)就是沒有放大作用，它不能象酶一樣能通過加工無數(shù)的底物分子而將信號放大所以一般都需強(qiáng)啟動子以驅(qū)動GFP 基因在細(xì)胞內(nèi)足量的表達(dá)也可用亞細(xì)胞分辨率的顯微成像系統(tǒng)檢測基因產(chǎn)物，靶入的基因被限制于一個細(xì)胞器內(nèi)，GFP 的濃度則相對提高了許多倍。

3.2融合標(biāo)記

應(yīng)用得***多和***成功的是GFP 同宿主蛋白構(gòu)成融合子來監(jiān)測宿主蛋白的定位和***后歸宿既有熒光又有宿主蛋白原有的正常功能和定位的融合蛋白效果更佳GFP 可融合于宿主蛋白的C 端或N 端，也可插入其內(nèi)部迄今為止，GFP 已成功地靶入了大部分細(xì)胞器中，如質(zhì)膜、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、分泌小體、線粒體、液泡和吞噬體等。

3.3 其它

GFP 分子生色團(tuán)的堅(jiān)固外層保護(hù)熒光不被熄滅，但同時也降低了GFP 分子的熒光對環(huán)境的敏感性通過隨機(jī)重組和基因定向突變得到了多種對環(huán)境敏感的GFP ，它們可用作環(huán)境指示劑如：對PH 敏感GFP 的可以測定細(xì)胞器內(nèi)的PH 值；通過基因工程，可GFP 在中插入磷酸化位點(diǎn)以便用磷酸化控制GFP 的熒光。另外，***近報(bào)道的利用靶入了水母GFP 基因的絲蛋白昆蟲病毒，感染蠶的幼蟲，用改造的基因取代了蠶的正?；?，當(dāng)蠶吐絲時這種絲是一種能在黑暗中發(fā)綠色熒光的纖維。

4. GFP應(yīng)用特點(diǎn)

GFP 這一新型報(bào)告基因，在短短幾年時間內(nèi)就得到了眾多研究者的青睞，其原因就在于它具有以下優(yōu)點(diǎn)：
(1)檢測方便：因?yàn)镚FP 熒光反應(yīng)不需要外加底物和輔助因子，也就不存在這些物質(zhì)可能難進(jìn)入細(xì)胞的問題，只需紫外光或藍(lán)光激發(fā)，即可發(fā)出綠色熒光，用熒光顯微鏡甚至肉眼就可以觀察到，且靈敏度高，對于單細(xì)胞水平的表達(dá)也可識別。

(2)熒光穩(wěn)定：GFP 對光漂白有較強(qiáng)的耐受性，能耐受長時間的光照；對高溫 (70℃) 、堿性、除垢劑、鹽、有機(jī)溶劑和大多數(shù)普通酶都有較強(qiáng)抗性。

(3)無毒害：從目前的研究結(jié)果來看，GFP 對生活的細(xì)胞基本無毒害，對目的基因的功能也沒有影響，轉(zhuǎn)化后細(xì)胞仍可連續(xù)傳代。

(4)共用性和通用性：首先表現(xiàn)在GFP 的表達(dá)幾乎不受種屬范圍的限制，在微生物、植物、動物中都獲得了成功的表達(dá)其次是GFP 沒有細(xì)胞種類和位置上的限制，在各個部位都可以表達(dá)發(fā)出熒光。

5) 易于構(gòu)建載體：由于GFP 分子量較小，編碼GFP 的基因序列也很短，為所以很方便地同其它序列一起構(gòu)建多種質(zhì)粒，而不至于使質(zhì)粒過大影響轉(zhuǎn)化頻率。

(6)可進(jìn)行活細(xì)胞定時定位觀察：對活細(xì)胞中蛋白的功能研究，更能接近自然真實(shí)的狀態(tài)。通過GFP 可實(shí)時觀察到外界信號刺激下，目的蛋白的變化過程，借助于近來廣泛使用的。

5. 展望

盡管GDP 基因作為新型報(bào)告基因越累越受到關(guān)注，但必盡只是近幾年的事，對GDP 的基礎(chǔ)理論研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)趕不上其應(yīng)用的速度。目前還存在很多的問題，如除了水母外的其他發(fā)光生物（如珊瑚、水螅等）中基因的克隆、是怎樣折疊成桶狀結(jié)構(gòu)的、突變是如何影響生色團(tuán)形成的、熒光波長是否可以再增加以適合更多種標(biāo)記和報(bào)告分子及中介轉(zhuǎn)移受體、可否在的分子內(nèi)部融合其他蛋白質(zhì)以及研究如何利用生物合成有色纖維、多數(shù)生物有微弱的自發(fā)熒光現(xiàn)象，并有著類似的激發(fā)和發(fā)射波長，影響某些GDP 的檢測，新生GDP 通過折疊和加工成為具有活性的性質(zhì)，過程十分緩慢紫外激發(fā)對某些GDP 有光漂白和光破壞作用，導(dǎo)致熒光型號快速喪失等。隨著對GDP 的基礎(chǔ)理論研究的發(fā)展和新型突變體的不斷出現(xiàn)，我們有理由相信這些問題***終會得到解決，它的開發(fā)及應(yīng)用將會帶來更加廣闊的前景。

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LUYOR-3415RG雙波長便攜式熒光蛋白激發(fā)光源

EGFP是GFP突變系

(1)RedShifted(紅偏移)GFP突變系(EGFP & GFPS65T)
  色基發(fā)生了氨基酸取代，λmax(Excitation)偏移至490nm附近。紅偏移突變系的更大激發(fā)峰都落在常用濾色片的波長范圍內(nèi)，所以獲得的熒光信號要比wtGFP明亮得多。同樣，F(xiàn)ACS和共焦顯微鏡的氬離子光源的發(fā)射波長為488nm，對RedShifted突變系的激發(fā)效率也明顯高于wtGFP。EGFP發(fā)生了雙氨基酸取代，Leu(亮氨酸)取代Phe64(苯丙氨酸)，Thr(蘇氨酸)取代Ser65(絲氨酸)(Cormack et al.,1996)?；诘攘咳芙獾鞍椎墓庾V分析，由于Em(消光系數(shù))的增加和色基構(gòu)型的高效率，EGFP在488nm處激發(fā)后燈熒光強(qiáng)度為wtGFP的35倍(Cormack et al.,1996;Yang et al.,1996)。在相同條件下(489nm)測得EGFP得Em為53，000cm-1M-1，而wtGFP為9，500CM-1M-1，GFPS65T為55，000cm-1M-1(Patterson et al.,1997)。EGFP的色基構(gòu)型在37℃比wtGFP或GFPS65T發(fā)光效率更高，在這一溫度下表達(dá)的EGFP可溶性蛋白95%為有效色基(Patterson et al.,1997)。GFPS65T為Thr取代Ser65的突變體(Heim et al.,1995)，同樣條件下，它的熒光強(qiáng)度強(qiáng)于wtGFP4～6倍，并且其的Redshifted激發(fā)峰位于490nm，但37℃時色基形成的效率不如EGFP。

Introduction to GFP

Green Fluorescent Protein (GFP) is a 26.9 kDa protein first identified in crystal jellyfish, Aequorea victoria. It was discovered that when exposed to blue or ultraviolet light the protein fluoresces green. After GFP was first expressed in E. coli in 1994 it was soon confirmed that GFP can also be successfully expressed in other organisms as well. Since then, not only have many fluorescent proteins of different colors been generated, but their function is enhanced to provide a faster and stronger fluorescent signal.

 
GFP Applications
?GFP is often used as a reporter of gene or protein expression. By detecting GFP expression it is possible to quantify the transfection/transduction efficiency. 
?By staining the cells with propidium iodide we can monitor the viability of the culture during GFP expression.
?In cultures that are co-transduced with GFP and RFP, the Cellometer has the capability to capture, analyze, and report the population of GFP positive, RFP positive, or dual positive.

eGFP: enhanced Green Fluorescent Protein 增強(qiáng)綠色熒光蛋白, EGFP是GFP突變系

目前應(yīng)用 較多的是 GFP的突變體：增強(qiáng)型綠色熒光蛋 白( E G F P )( 6 4位苯丙一亮) ， 發(fā)射出的熒光強(qiáng)度 比GFP大 6 倍以上， 因此， 比GFP更適合作為 一種報(bào)告基 因來研究基因表達(dá)、 調(diào)控、 細(xì)胞分化及蛋 白質(zhì) 在生物體內(nèi)定位和轉(zhuǎn)運(yùn)等。綠色熒光蛋白(GreenFluorescent Protein,簡稱GFP)是一種在美國西北海岸所盛產(chǎn)的水母中所發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)。這類學(xué)名為Aequorea victoria的水母有著美麗的外表,生存歷史超過1.6億年。1962年,下村修正是在這種水母的發(fā)光器官內(nèi)發(fā)現(xiàn)天然綠色熒光蛋白。它之所以能夠發(fā)光,是因在其包含238個氨基酸的序列中,第65至67個氨基酸(絲氨酸—酪氨酸—甘氨酸)殘基,可自發(fā)地形成一種熒光發(fā)色團(tuán)。

熒光蛋白定位激發(fā)光源LUYOR-3260放置在物鏡前方的阻擋濾光片可根據(jù)要求規(guī)格訂做。此激發(fā)光源與護(hù)目鏡LUV-495共同使用，可在動物設(shè)備的固定位置如消毒層流柜直接觀察綠色熒光蛋白（GFP）。兩個握桿之間的空間可容納小動物的籠子（如小鼠）。熒光蛋白定位激發(fā)光源可與熒光蛋白觀察鏡LUV-495或 LUV-590起使用直接觀察綠色熒光蛋白（GFP）或黃色熒光蛋白（YFP）。