我們經(jīng)常收到咨詢(xún)“你們有 488nm 的光源嗎？”

咨詢(xún)488nm 的光源的老師通常是:

• 他們正在使用 GFP（綠色熒光蛋白）;

• 他們咨詢(xún)了同事或查看的文獻(xiàn)，確定了GFP 的激發(fā)/發(fā)射值為 488/508 nm;

• 他們知道他們需要使用熒光，但他們并不真正了解它的工作原理細(xì)節(jié);

• 他們了解到 LUYOR 提供熒光蛋白激發(fā)光源，他們想知道我們是否有針對(duì)他們特定應(yīng)用的解決方案。

這個(gè)問(wèn)題沒(méi)有錯(cuò)。您可以在不了解熒光的情況下使用它。如果您需要選擇使用熒光蛋白激發(fā)光源，那么查閱參考文獻(xiàn)以獲得指導(dǎo)，然后詢(xún)問(wèn)這些參考文獻(xiàn)告訴您什么，這是完全合乎邏輯的。您會(huì)發(fā)現(xiàn) GFP 的 488/508nm 是正確的——這些是激發(fā)GFP熒光和觀(guān)察發(fā)射光的波長(zhǎng)。

關(guān)于熒光激發(fā)工作原理，***相關(guān)的一點(diǎn)是，熒光激發(fā)或發(fā)射沒(méi)有單一的波長(zhǎng)。熒光物體可以在一定波長(zhǎng)范圍下被激發(fā)，由此產(chǎn)生的發(fā)射會(huì)延伸到一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)。這個(gè)范圍稱(chēng)為激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。

例如，下圖中的曲線(xiàn)顯示了***常用的熒光蛋白 eGFP（增強(qiáng)型 GFP）的激發(fā)和發(fā)射光譜。藍(lán)色曲線(xiàn)是激發(fā)光譜，綠色曲線(xiàn)是發(fā)射光譜。峰位于 488 nm 和 508 nm，正是表格告訴您它們應(yīng)該在的位置。488nm 是激發(fā)eGFP的***有效波長(zhǎng)，但它肯定不是唯一可以激發(fā)熒光的波長(zhǎng)。

GFP 激發(fā)和發(fā)射光譜

您可以將激發(fā)光譜看作各種波長(zhǎng)的光對(duì)激發(fā)GFP熒光的相對(duì)效率的圖表。如果 488nm 處的 100 個(gè)單位的激發(fā)光產(chǎn)生 x 強(qiáng)度的熒光，那么 450nm 處大約需要 200 個(gè)單位的光才能產(chǎn)生相同的強(qiáng)度，因?yàn)?450nm 光被吸收并產(chǎn)生熒光的可能性大約是 488nm 光的一半。但這并不意味著您不能使用 450nm激發(fā)光！

發(fā)射光譜的情況略有不同，因?yàn)槟鸁o(wú)法選擇輸出的波長(zhǎng)。來(lái)自特定熒光團(tuán)的熒光的性質(zhì)是發(fā)射光譜與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)。也就是說(shuō)，無(wú)論您在 440、450、460nm 等處激發(fā)，發(fā)射的光都將分布在相同的發(fā)射光譜上。激發(fā)光譜在選擇激發(fā)熒光的光源時(shí)發(fā)揮作用。發(fā)射光譜有助于理解勢(shì)壘濾波器的作用。

在理想的熒光蛋白激發(fā)光源系統(tǒng)中：

激發(fā)光源將盡可能靠近激發(fā)峰值來(lái)激發(fā)熒光

熒光濾光片將盡***大努力傳輸發(fā)射光

激發(fā)光源和屏障濾光片協(xié)同工作，以消除任何激發(fā)光通過(guò)熒光濾光片或熒光觀(guān)察眼鏡。

在實(shí)際系統(tǒng)中，通常需要對(duì)光譜特性（激發(fā)和發(fā)射光譜）以及光源、濾光片和熒光觀(guān)察眼鏡的特性進(jìn)行一些權(quán)衡。以上***后一點(diǎn)很關(guān)鍵 - 如果過(guò)多（或任何）激發(fā)光通過(guò)熒光觀(guān)察眼鏡，它會(huì)嚴(yán)重降低您看到所需熒光的能力，尤其是在熒光不是很強(qiáng)的情況下。

很大一部分挑戰(zhàn)是由于許多應(yīng)用（如 GFP）中使用的熒光團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射非常接近。這使得同時(shí)服務(wù)于所有三個(gè)要點(diǎn)的光源和濾光片配對(duì)變得具有挑戰(zhàn)性，特別是當(dāng)您試圖以合理的價(jià)格組裝一個(gè)強(qiáng)大的系統(tǒng)時(shí)。

為了滿(mǎn)足所有這些要求，LUYOR的熒光蛋白激發(fā)光源通常在激發(fā)光譜的“肩部”激發(fā)，而不是在峰值處激發(fā)。遠(yuǎn)離峰為選擇屏障濾光片提供了更多的“空間”，該濾光片 （a） 有效透射熒光發(fā)射，（b） 阻擋任何反射的激發(fā)光。在 GFP 的情況下，LUYOR的RB 光源主要在 440-460nm 范圍內(nèi)發(fā)射，該范圍顯示該范圍能夠激發(fā) GFP 熒光，而成對(duì)的激發(fā)濾光片（截止波長(zhǎng)約為 500nm 的長(zhǎng)波通或帶通 （500 – 560nm））可以很好地傳輸發(fā)射，同時(shí)在阻擋反射光方面做得很好， 實(shí)現(xiàn)良好的觀(guān)看對(duì)比度。

我們希望這篇文章對(duì)您有所幫助，如果您有任何問(wèn)題，可以聯(lián)系我們。